透皮吸收测试是评估外用药物、化妆品安全性与有效性的核心环节，传统动物模型或二维细胞培养因物种差异、结构单一等局限，难以精准模拟人体皮肤的多层屏障与生理功能。3D打印技术凭借个性化、高仿真的特性，成为构建皮肤模型的关键手段。明确其构建流程，不仅能提升模型的生物学相关性，更能为透皮测试结果的可靠性奠定基础。本文围绕透皮吸收测试需求，详细拆解3D打印皮肤模型的全流程细节。
明确透皮测试导向的模型需求
构建3D打印皮肤模型的第一步，是基于测试目标界定核心参数。不同测试对象对模型结构的要求差异显著——若测试小分子脂溶性药物，需重点模拟表皮层的角质层屏障；若针对大分子生物制剂（如多肽），则需构建包含真皮层的全层模型，以评估药物在真皮基质中的扩散行为。
测试指标也会影响模型设计：关注毒性需引入角质形成细胞、成纤维细胞；侧重渗透率则需明确厚度（表皮层10-20μm、真皮层500μm）与孔隙率（匹配皮肤水合状态）。部分高端测试还要求模型具备血管化结构，模拟药物的系统吸收过程。
这一步需跨学科协作。配匹度高标目试：药剂学家明确药物理化性质与测试终点，组织工程学家将需求转化为可打印参数（如层厚、细胞密度），确保模型与测试目标高度匹配。
筛选适配的3D打印材料
3D打印皮肤模型的材料需同时满足生物相容性、可打印性与生理模拟性。天然聚合物因贴近细胞外基质（ECM）是首选——胶原Ⅰ型能提供细胞粘附位点，促进角质形成细胞分化；明胶经甲基丙烯酸酯化（GelMA）改性后，可光交联固化，适合构建精细表皮层。
合成聚合物用于提升机械强度：PLGA降解速率可控，适合长期测试的真皮支架；PCL熔点低（约60℃），打印时不损伤细胞，常用于血管化框架。
水凝胶体系设计是关键：需调整交联密度控制孔隙率——孔隙过大易导致药物渗漏，过小阻碍细胞迁移。材料溶胀率需匹配皮肤水含量（约70%），避免结构变形影响测试结果。部分研究还会添加透明质酸模拟保水功能，或VEGF诱导血管生成。
制备高活性的细胞源
细胞是模型的功能核心，常用类型包括角质形成细胞（表皮屏障）、成纤维细胞（真皮ECM）、内皮细胞（血管化）。细胞源选择需平衡可用性与相关性：自体细胞无免疫排斥但成本高，永生化细胞系（如HaCaT）易扩增但可能丢失原代功能，iPSC分化细胞兼具通用性与生理活性，是未来主流。
细胞预处理需注意：打印前将细胞与材料混合（密度1×10^6-5×10^6 cells/mL），添加FBS或EGF维持活性。部分研究会对细胞预分化——如角质形成细胞在气液界面培养2-3天，形成早期角质层再打印，提升屏障功能。
细胞活性检测是关键：打印前用台盼蓝或CCK-8法确保存活率≥90%，否则模型功能缺失，无法反映药物真实透皮行为。
优化3D打印工艺参数
工艺选择需结合材料与结构：挤出式打印适合粘性水凝胶（如GelMA），实现细胞-材料均匀混合；光固化打印（SLA/DLP）分辨率高（10μm），适合角质层精细结构；喷墨式打印可定点沉积细胞，构建血管化网络。
关键参数优化直接影响模型质量：打印速度需匹配材料固化时间——过快会导致未固化材料变形，过慢则降低细胞活性；压力控制在10-50kPa，避免破坏细胞膜；层厚是分层核心——表皮层10-20μm、真皮层50-100μm，确保细胞密度均匀。
温度控制不容忽视：热敏材料（如明胶）需维持37℃，避免凝固堵塞喷头；合成聚合物（如PCL）需加热至熔点以上，但需快速冷却防止热损伤细胞。部分设备采用双喷头技术，同步打印功能层与结构层，提升效率。
分层构建皮肤模型的功能结构
模型构建遵循“从内到外”顺序：先打印真皮层，再构建表皮层，最后添加血管化结构。真皮层先用PCL打印支架（孔隙率80%），再填充成纤维细胞-胶原混合物，模拟ECM环境；成纤维细胞会分泌自身胶原，逐渐替代打印材料。
表皮层待真皮层培养3-5天（成纤维细胞贴附）后，用GelMA混合角质形成细胞打印10-20μm薄层覆盖，随后置于气液界面（ALI）培养——液面接触真皮层、表皮层暴露空气，诱导角质形成细胞分化为角质层，形成屏障功能。
血管化结构需在真皮层打印内皮细胞-水凝胶混合物，内皮细胞会自发形成管腔，模拟血液循环，确保药物能进入系统循环——这对评估系统吸收的测试至关重要。部分研究还会添加毛囊干细胞，诱导毛囊形成，用于生发液等产品测试。
模型的后处理与成熟培养
打印完成的模型需后处理：用PBS冲洗去除未固化材料，避免残留影响细胞活性；用紫外光或京尼平增强材料强度，防止培养中变形。
成熟培养是功能形成的关键：先在37℃、5%CO₂、95%湿度下用完全培养基（含FBS、EGF）培养3天，促进细胞贴附增殖；再切换分化培养基（减少FBS、加维生素C），诱导角质层形成。
气液界面培养是表皮成熟的核心——模型置于Transwell小室，液面仅接触真皮层，表皮层暴露空气，刺激角质形成细胞表达角蛋白10（分化标记）与丝聚蛋白（屏障标记）。成熟培养需14-21天，直到模型TEWL值（经皮水分流失）与人体皮肤（5-15g/m²/h）一致。
模型的验证与表征
模型需通过多维度验证才能用于测试。结构表征用HE染色观察分层：表皮层需见角质层（红染）与基底层（蓝染），真皮层需有成纤维细胞均匀分布；SEM观察孔隙结构：真皮层孔隙50-100μm适合细胞迁移，表皮层<10μm模拟屏障。
功能表征用TEWL评估屏障——模型值需与人体接近，否则无法反映药物渗透；渗透率测试用Franz扩散池：模型固定在池间，上层加药物、下层接接收液，定时取样算渗透系数（Kp），若与人体数据差异≤20%则功能合格。
细胞表型用免疫荧光验证：角质形成细胞需表达角蛋白14（基底层）与10（分化），成纤维细胞表达波形蛋白与胶原Ⅰ，内皮细胞表达CD31——只有标记物水平与人体一致，模型才能用于透皮测试。